jueves, 31 de julio de 2008

Chagas

Hemoaglutinación Indirecta para Chagas


La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por el Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad. Durante la fase aguda, el diagnóstico se efectúa directamente mediante la comprobación de los parásitos en sangre o por métodos inmunológicos que detecten anticuerpos específicos. Durante la fase crónica, se pueden usar métodos inmunológicos como la reacción de aglutinación de látex, hemoaglutinación, aglutinación directa, inmunofluorescencia y últimamente ELISA. La hemoaglutinación indirecta (HAI), también llamada hemoaglutinación reversa pasiva, se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos (que en este caso son anti-T. cruzi) de producir aglutinación específica en presencia de glóbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) que son capaces de aglutinar glóbulos rojos de distintas especies. Su presencia se investiga enfrentando el suero con GR no sensibilizados. Los anticuerpos interferentes se eliminan mediante tratamiento con 2-mercaptoetanol.
OBJETIVOS
Identificar la presencia de Chagas mediante el estudio serológico de hemoaglutinación indirecta
REACTIVOS
- Reconstituyente HAI: solución fisiológica taponada a P.D. 7.
- Antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensibilizados con antígenos citoplasmáticos de T. cruzi.
- Glóbulos rojos no sensibilizados: suspensión al 1% de eritrocitos de carnero no sensibilizados, para control de heterofilia.
- Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH 7,5, con colorante inerte. Agregar 0,2ml de Solución Proteica para cada 10ml de Buffer HAI. Mezclar, rotular y fechar (Preparado dura 5 días a 2 – 10ºC)
- Solución Proteica: solución de albúmina bovina al 10%.
- Control Positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos contra Tripanosoma cruzi.
- Control Negativo: suero no reactivo, inactivado.
- Solución fisiológica.
MUESTRA
- Recolección: el paciente debe estar preferentemente en ayunas. Obtener suero de la manera usual. No usar plasma.
- Sustancias interferentes conocidas: hemólisis o hiperlipemia producen resultados erróneos.
- Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: el suero debe ser preferentemente fresco. En caso de no procesarse en el momento, puede conservarse en el refrigerador (2-10ºC) durante no más de 72hs contadas a partir del momento de la extracción. Para períodos más prolongados de conservación, congelar (a -20ºC), evitando reiterar tal procedimiento.
MATERIAL REQUERIDO
- Policubetas con pocillos en U (Para eliminar la carga electrostática es pasar un trapo húmedo por la base de la misma)
- Microdilutores (25ul) o micropipetas automáticas (25 ul)
- Tubos de ensayo y material volumétrico adecuado
- Cinta adhesiva
- Papel de filtro
PROCEDIMIENTO
- Colocar 25ul de Diluyente de Sueros HAI en todos los pocillos a usar de la policubeta.
- Tomar una alícuota de 25ul de la muestra “suero” y colocar en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para asegurar una correcta dilución de la muestra.
- Con una micropipeta automática de 25ul, homogeneizar por carga y descarga. Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilución 1/2), pasando los microdilutores al pocillo siguiente (dilución 1/4) y así sucesivamente hasta la dilución que se desea investigar (por ej.: 1/8, 1/16, 1/32)
- Transferir 25ul de pocillo a pocillo hasta la dilución que se desee investigar.
- Descartar los últimos 25ul.
- Colocar en los pocillos conteniendo las diluciones 1/2 y 1/4, la cantidad de 25ul de glóbulos rojos no sensibilizados para control de heterofília.
- En el resto de los pocillos, agregar 25ul de Antígeno HAI.
- Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta.
- Dejar en reposo, a resguardo de vibraciones, durante 90 minutos.
- Leer a partir de los 90 minutos.
- Se puede aumentar la nitidez de la apreciación, leyendo sobre un espejo, iluminando la placa desde arriba e interponiendo un papel blanco y traslúcido entre la policubeta y la fuente de luz.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón o pequeño anillo de bordes regulares.
Reactivo: formación de una película o manto que cubre el 50% o más del fondo de los pocillos, hasta el último posillo, informándose con el título en dilución (ejemplo Positivo dil.1:64)
PROCEDIMIENTO: TÉCNICA SCREENING O DESCARTE POR 1 TITULO
- Colocar 25ul de Diluyente de Sueros HAI en todos los pocillos a utilizar de la policubeta (un pocillo por cada muestra).
- Colocar 5ul de la muestra “suero” en el pocillo que contiene el Diluyente de Sueros HAI, rotando la misma para obtener un buen mezclado y distribuirlo sobre todo el fondo del pocillo.
- Agregar 25ul de Antígeno HAI reconstituido y homogeneizado a cada pocillo.
- Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales, durante 30 segundos por lo menos, para asegurar un buen mezclado.
- Dejar reposar, al resguardo de vibraciones durante 2 horas.
- Efectuar la lectura. En caso de que la lectura de los resultados se efectúe en un plazo mayor de 2 horas, la policubeta deberá taparse con una cinta adhesiva transparente para evitar evaporaciones.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón.
Reactivo: formación de una película o manto en el fondo de los pocillos. En caso de observar la presencia de un pequeño anillo de bordes regulares, la muestra se considerará dudosa y deberá ser ensayada por otro método.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
- Vibraciones accidentales durante el reposo necesario para el desarrollo de la reacción.
- Sueros envejecidos o congelados y descongelados repetidamente.
- Contaminaciones accidentales de los reactivos o del material empleado en el ensayo.
- Exceso o defecto de Diluyente de Sueros HAI en los pocillos de la policubeta.
- Diluyente de Sueros HAI que tenga más de 5 días de preparación.
- En poblaciones endémicas, empleando el método de HAI, el 98% de los títulos menores a 1/8 y el 95% de los títulos mayores o iguales a 1/8 fueron confirmados por los métodos tomados como referencia.
- En poblaciones no endémicas, el 100% de los individuos sanos presentó títulos menores a 1/8 determinados por HAI.
- En el 100% de los individuos con serología positiva confirmada por los métodos tomados como referencia y con parasitosis demostrada por xenodiagnóstico y/o hemocultivo, se observaron títulos mayores o iguales a 1/32 determinados con Chagatest HAI.
- Policubetas rayadas por uso reiterado. No se aconseja reutilizar pocillos.
- Falta de homogeneización de los reactivos antes de su uso.
RESULTADOS

CONCLUSIÓN

EVALUACIÓN

CUESTIONARIO
1. Mencione las características clínicas que presenta una persona que padece Chagas
2. Mencione otras pruebas de laboratorio que sean capaces de identificar la enfermedad de Chagas
3. Esquematice el tipo de reacción que sucede en caso de positividad y negatividad en la prueba de HAI-Chagas
4. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del test de HAI-Chagas?
5. Describa las características principales del agente causal de la enfermedad del Chagas
6. ¿Qué significado tiene el informe de laboratorio Positivo dilución 1:32 y Positivo dilución 1:1024?
7. Describa las complicaciones que padecen las personas enfermas de Chagas
BIBLIOGRAFÍA
- Abbas A., Lichtman A., Pober J.: Inmunología Celular y Molecular 5ª edición. Ed. McGraw Hill – Interamericana. España 2004. Signatura Topográfica 616.079 Ab19 c.4
- Rojas W.: Inmunología 13ª edición. Investigaciones biológicas. Colombia 2004. Signatura Topográfica 616.079 R63
- Requeiro J., Lopez: Inmunología, Biología y Patología del Sistema Inmune Editorial Panamericana. 1996
- Russel T.: Inmunología 2ª edición. 1999